马鼻疽防治技术规范

　　马鼻疽(Glanders)是由假单胞菌科假单胞菌属的鼻疽假单胞菌感染引起的一种人兽共患传染病。我国将其列为二类动物疫病。

　　为预防、控制和消灭马鼻疽，依据《中华人民共和国动物防疫法》及有关的法律法规，特制定本规范。

　　1 适用范围

　　本规范规定了马鼻疽的诊断、疫情报告、疫情处理、防治措施、控制和消灭标准。

　　本规范适用于中华人民共和国境内从事马属动物的饲养、经营和马属动物产品加工、经营，以及从事动物防疫活动的单位和个人。

　　2 诊断

　　2.1 流行特点

　　以马属动物最易感，人和其它动物如骆驼、犬、猫等也可感染。鼻疽病马以及患鼻疽的其它动物均为本病的传染源。自然感染主要通过与病畜接触，经消化道或损伤的皮肤、黏膜及呼吸道传染。本病无季节性,多呈散发或地方性流行。在初发地区，多呈急性、暴发性流行；在常发地区多呈慢性经过。

　　2.2 临床特征

　　本病的潜伏期为6个月。

　　临床上常分为急性型和慢性型。

　　急性型 病初表现体温升高，呈不规则热（39～41℃）和颌下淋巴结肿大等全身性变化。肺鼻疽主要表现为干咳，肺部可出现半浊音、浊音和不同程度的呼吸困难等症状；鼻腔鼻疽可见一侧或两侧鼻孔流出浆液、黏液性脓性鼻汁，鼻腔黏膜上有小米粒至高粱米粒大的灰白色圆形结节突出黏膜表面，周围绕以红晕，结节坏死后形成溃疡，边缘不整，隆起如堤状，底面凹陷呈灰白色或黄色；皮肤鼻疽常于四肢、胸侧和腹下等处发生局限性有热有痛的炎性肿胀并形成硬固的结节。结节破溃排出脓汁，形成边缘不整、喷火口状的溃疡，底部呈油脂样，难以愈合。结节常沿淋巴管径路向附近组织蔓延，形成念珠状的索肿。后肢皮肤发生鼻疽时可见明显肿胀变粗。

　　慢性型 临床症状不明显，有的可见一侧或两侧鼻孔流出灰黄色脓性鼻汁，在鼻腔黏膜常见有糜烂性溃疡，有的在鼻中膈形成放射状斑痕。

　　2.3 病理变化

　　主要为急性渗出性和增生性变化。渗出性为主的鼻疽病变见于急性鼻疽或慢性鼻疽的恶化过程中；增生性为主的鼻疽病变见于慢性鼻疽。

　　肺鼻疽 鼻疽结节大小如粟粒，高粱米及黄豆大，常发生在肺膜面下层，呈半球状隆起于表面，有的散布在肺深部组织，也有的密布于全肺，呈暗红色、灰白色或干酪样。

　　鼻腔鼻疽 鼻中膈多呈典型的溃疡变化。溃疡数量不一，散在或成群，边缘不整，中央象喷火口，底面不平呈颗粒状。鼻疽结节呈黄白色，粟粒呈小豆大小，周围有晕环绕。鼻疽斑痕的特征是呈星芒状。

　　皮肤鼻疽 初期表现为沿皮肤淋巴管形成硬固的念珠状结节。多见于前驱及四肢，结节软化破溃后流出脓汁，形成溃疡，溃疡有堤状边缘和油脂样底面，底面覆有坏死性物质或呈颗粒状肉芽组织。

　　2.4 实验室诊断

　　2.4.1 变态反应诊断

　　变态反应诊断方法有鼻疽菌素点眼法、鼻疽菌素皮下注射法、鼻疽菌素眼睑皮内注射法，常用鼻疽菌素点眼法（见附件）。

　　2.4.2 鼻疽补体结合反应试验（见附件）。该方法为较常用的辅助诊断方法，用于区分鼻疽阳性马属动物的类型，可检出大多数活动性患畜。

　　2.5 结果判定

　　无临床症状慢性马鼻疽的诊断以鼻疽菌素点眼为主，血清学检查为辅；开放性鼻疽的诊断以临床检查为主，病变不典型的，则须进行鼻疽菌素点眼试验或血清学试验。

　　2.5.1 具有明显鼻疽临床特征的马属动物，判定为开放性鼻疽病畜。

　　2.5.2 鼻疽菌素点眼阳性者，判定为鼻疽阳性畜。

　　3 疫情报告

　　3.1 任何单位和个人发现疑似疫情，应当及时向当地动物防疫监督机构报告。

　　3.2 动物防疫监督机构接到疫情报告并确认后，按《动物疫情报告管理办法》及有关规定及时上报。

　　4 疫情处理

　　4.1 发现疑似患病马属动物后，畜主应立即隔离患病马属动物，限制其移动，并立即向当地动物防疫监督机构报告。动物防疫监督机构接到报告后，应及时派员到现场进行诊断，包括流行病学调查、临床症状检查、病理检查、采集病料、实验室诊断等，并根据诊断结果采取相应防治措施。

　　4.2 确诊为马鼻疽病畜后，当地县级以上人民政府畜牧兽医行政管理部门应当立即派人到现场，划定疫点、疫区、受威胁区; 采集病料、调查疫源，及时报请同级人民政府对疫区实行封锁，并将疫情逐级上报国务院畜牧兽医行政管理部门。县级以上人民政府根据需要组织有关部门和单位采取隔离、扑杀、销毁、消毒等强制性控制、扑灭措施，并通报毗邻地区。

　　4.2.1 划定疫点、疫区、受威胁区

　　疫点 指患病马属动物所在的地点，一般是指患病马属动物的同群畜所在的养殖场（户）或其它有关屠宰、经营单位；散养情况下，疫点指患病马属动物所在的自然村（屯）。

　　疫区 由疫点外延3公里范围内的区域。疫区划分时注意考虑当地的饲养环境和天然屏障（如河流、山脉等）。

　　受威胁区 是指疫区外延5公里范围内的区域。

　　4.2.2 封锁

　　按规定对疫区实行封锁。疫区封锁期间，染疫和疑似染疫的马属动物及其产品不得出售、转让和调群,禁止移出疫区；繁殖马属动物要用人工授精方法进行配种；种用马属动物不得对疫区外马属动物配种；对可疑马属动物要严格隔离检疫；关闭马属动物交易市场。禁止非疫区的马属动物进入疫区，并根据扑灭疫情的需要对出入封锁区的人员、运输工具及有关物品采取消毒和其它限制性措施。

　　4.2.3 隔离

　　当发生马鼻疽时，要及时应用变态反应等方法在疫点对马属动物进行检测，根据检测结果，将马属动物群分为患病群、疑似感染群和假定健康群三类。立即扑杀患病群，隔离观察疑似感染群、假定健康群。经6个月观察，不再发病方可解除隔离。

　　4.2.4 检测

　　疫区内须对疑似感染马属动物和周围的马属动物隔离饲养，每隔6个月检测一次，受威胁区每年进行两次血清学（鼻疽菌素试验）监测，直至全部阴性为止;无疫区每年进行一次血清学检测。

　　4.2.5 扑杀

　　对临床病畜和鼻疽菌素试验阳性畜，均须在不放血条件下进行扑杀。

　　4.2.6 销毁处理

　　病畜和阳性畜及其胎儿、胎衣、排泄物等按照GB16548《畜禽病害肉尸及其产品无害化处理规程》进行无害化处理。焚烧和掩埋的地点应选择距村镇、学校、水源、牧场、养殖场等1公里以外的地方，挖深坑将尸体焚烧后掩埋，掩埋土层不得低于1.5米。

　　4.2.7 消毒

　　对患病或疑似感染马属动物污染的场所、用具、物品等严格进行消毒；污染的垫料及粪便等采取堆积泥封发酵、高温等方法处理后方可使用。

　　4.2.8 封锁的解除

　　疫区从最后一匹患病马属动物扑杀处理后，并经彻底消毒等处理后，对疫区内监测90天，未见新病例；且经过半年时间采用鼻疽菌素试验逐匹检查，未检出鼻疽菌素试验阳性马属动物的，并对所污染场所、设施设备和受污染的其它物品彻底消毒后，经当地动物防疫监督机构检查合格，由原当地县级以上兽医行政主管部门报请原发布封锁令人民政府解除封锁。

　　5 预防与控制

　　5.1 加强饲养管理，做好消毒等基础性防疫工作，提高马匹抗病能力。

　　5.2 检疫

　　异地调运马属动物，必须来自非疫区；出售马属动物的单位和个人，应在出售前按规定报检，经当地动物防疫监督机构检疫，证明马属动物装运之日无马鼻疽症状，装运前6个月内原产地无马鼻疽病例，装运前15天经鼻疽菌素试验或鼻疽补体结合反应试验，结果为阴性，并签发产地检疫证后，方可启运。

　　调入的马属动物必须在当地隔离观察30天以上，经当地动物防疫监督机构连续两次（间隔5～6天）鼻疽菌素试验检查，确认健康无病，方可混群饲养。

　　运出县境的马属动物，运输部门要凭当地动物防疫监督机构出具的运输检疫证明承运，证明随畜同行。运输途中发生疑似马鼻疽时，畜主及承运者应及时向就近的动物防疫监督机构报告，经确诊后，动物防疫监督机构就地监督畜主实施扑杀等处理措施。

　　5.3 监测

　　稳定控制区 每年每县抽查200匹（不足200匹的全检），进行鼻疽菌素试验检查，如检出阳性反应的，则按控制区标准采取相应措施。

　　消灭区 每县每年鼻疽菌素试验抽查马属动物100匹（不足100匹的全检）。

　　6 控制和消灭标准

　　6.1 控制标准

　　6.1.1 县级控制标准

　　控制县（市、区、旗）应达到以下三项标准：

　　A、全县（市、区、旗）范围内,连续两年无马鼻疽临床病例。

　　B、全县（市、区、旗）范围内连续两年检查，每年抽检200匹（不足200匹全检），经鼻疽菌素试验阳性率不高于0.5%。

　　C、鼻疽菌素试验阳性马属动物全部扑杀，并做无害化处理。

　　6.1.2 市级控制标准

　　全市（地、盟、州）所有县（市、区、旗）均达到控制标准。

　　6.1.3 省级控制标准

　　全省所有市（地、盟、州）均达到控制标准。

　　6.1.4 全国控制标准

　　全国所有省（市、自治区）均达到控制标准。

　　6.2 消灭标准

　　6.2.1 县级马鼻疽消灭标准必须具备以下两项条件：

　　A、达到控制标准后，全县（市、区、旗）范围内连续两年无马鼻疽病例。

　　B、达到控制标准后，全县（市、区、旗）范围内连续两年鼻疽菌素试验检查，每年抽检100匹（不足100匹者全检），全部阴性。

　　6.2.2 市级马鼻疽消灭标准

　　全市（地、盟、州）所有县（市、区、旗）均达到消灭标准。

　　6.2.3 省级马鼻疽消灭标准

　　全省所有市（地、盟、州）均达到消灭标准。

　　6.2.4 全国马鼻疽消灭标准

　　全国所有省（市、自治区）均达到消灭标准。

 

　　附件

马鼻疽诊断技术及判定标准

　　1 总则

　　1.1 为统一马鼻疽（以下简称鼻疽）检疫诊断技术及判定标准，并提高鼻疽诊断技术及判定标准的准确性，特制定鼻疽诊断技术及判定标准（以下简称本标准）。

　　1.2 对马、驴、骡进行鼻疽检疫时，统一按本标准规定办理。

　　1.3 本标准以鼻疽菌素点眼反应为主。必要时进行补体结合反应、鼻疽菌素皮下注射反应或眼睑皮内注射反应。

　　1.4 凡鼻疽临床症状显著的马、骡、驴，确认为开放性鼻疽的，可以不进行检疫。

　　1.5 各种检疫记录表（见7 附件），须保存2年以上。

　　2 鼻疽菌素点眼操作方法

　　2.1 器材药品：

　　2.1.1 鼻疽菌素、硼酸、来苏尔、脱脂棉、纱布、酒精、碘酒、记录表。

　　2.1.2 点眼器、唇（耳）夹子、煮沸消毒器、镊子、消毒盘、工作服、口罩、线手套。

　　注意：在所盛鼻疽菌素用完或在点眼过程中被污染（接触结膜异物）的点眼器，必须消毒后再使用。  

　　2.2 点眼前必须两眼对照，详细检查眼结膜和单、双瞎等情况，并记录。眼结膜正常者可进行点眼，点眼后检查颌下淋巴结，体表状况及有无鼻漏等。

　　2.3 规定间隔5～6日做两回点眼为一次检疫，每回点眼用鼻疽菌素原液3～4滴（0.2～0.3mL），两回点眼必须点于同一眼中，一般应点于左眼，左眼生病可点于右眼，并在记录中说明。

　　2.4 点眼应在早晨进行，最后第9小时的判定须在白天进行。

　　2.5 点眼前助手固定马匹，术者左手用食指插入上眼睑窝内使瞬膜露出，用拇指拨开下眼睑构成凹兜，右手持点眼器保持水平方向，手掌下缘支撑额骨眶部，点眼器尖端距凹兜约1cm，拇指按胶皮乳头滴入鼻疽菌素3～4滴。

　　2.6 点眼后注意系栓。防止风沙侵入、阳光直射眼睛及动物自行磨擦眼部。

　　2.7 判定反应。在点眼后3、6、9小时，检查3次，尽可能于注射24小时处再检查一次。判定时先由马头正面两眼对照观察，在第6小时要翻眼检查，其余观察必要时须翻眼。细查结膜状况，有无眼眦，并按判定符号记录结果。

　　2.8 每次检查点眼反应时均应记录判定结果。最后判定以连续两回点眼之中最高一回反应为准。

　　2.9 鼻疽菌素点眼反应判定标准：

　　2.9.1 阴性反应：点眼后无反应或结膜轻微充血及流泪，为阴性。记录为“－”。

　　2.9.2 疑似反应：结膜潮红，轻微肿胀，有灰白色浆液性及黏液性（非脓性）分泌物（眼眦）的，为疑似阳性。记录为“±”。

　　2.9.3 阳性反应：结膜发炎，肿胀明显，有数量不等脓性分泌物（眼眦）的为阳性。记录为“＋”。

　　3 鼻疽菌素皮下注射（热反应操作方法）

　　3.1 药品器材

　　3.1.1 鼻疽菌素原液、来苏尔、酒精、碘酒、脱脂棉、纱布、记录表。

　　3.1.2 工作服、口罩、线手套、毛刷、毛剪、耳夹子、注射器、针头、体温计、煮沸消毒器、消毒盘、镊子。  

　　3.2 皮下注射前一日做一般临床检查，早午晚分别测量并记录体温，体温正常的方可做皮下注射。

　　3.3 皮下注射前所测3次体温，其中如有一次超过39℃，或3次体温平均数超过38.5℃，或在前一次皮下注射后尚未经过一个半月以上的，均不得做皮下注射。

　　3.4 注射部位通常在左颈侧或胸部肩胛前，术部剪毛消毒后注射鼻疽菌素原液1mL。

　　3.5 牲畜在注射后24小时内不得使役，不得饮冷水。

　　3.6 注射通常在零点进行。注射后6小时起测温，每隔2小时测一次（即注射后6、8、10、12、14、16、18、20、22、24小时），连续测温10次后，再于36小时测温一次，详细记录并划出体温曲线，同时记录局部肿胀程度，以备判定。局部肿胀以手掌大（横径10cm）为明显反应。

　　3.7 皮下注射鼻疽菌素的马、驴、骡可发生体温反应及局部或全身反应。

　　3.7.1 体温反应：鼻疽病畜一般在皮下注射鼻疽菌素后6～8小时体温开始上升，12～16小时体温上升到最高，此后逐渐降低，有的在注射30～36小时后，体温再度轻微上升。

　　3.7.2 局部反应：注射部位发热，肿胀疼痛，以注射后24～36小时最为显著，直径可达10～20cm，并逐渐消散，有时肿胀可存在2～3天。

　　3.7.3 全身反应：注射后精神不振，食欲减少，呼吸短促，脉搏加快，步态踉跄、战栗，大小便次数增加，颌下淋巴结肿大。

　　3.8 鼻疽菌素皮下注射（热反应）判定标准如下：

　　3.8.1 阴性反应：体温升至摄氏39℃以下并无局部或全身反应。

　　3.8.2 疑似反应：体温升至39℃（不超过39.6℃），有轻微全身反应及局部反应者，或体温升至40℃以上稽留并无局部反应时，也可认为疑似反应。

　　3.8.3 阳性反应：体温升至40℃以上稽留及有轻微局部反应，或体温在39℃以上稽留并有显著的局部反应（肿胀横径10cm以上）或有全身反应。

　　4 鼻疽菌素眼睑皮内注射操作方法

　　4.1 药品及器材

　　4.1.1 鼻疽菌素（用前随时稀释，鼻疽菌素1份用0.5%石炭酸生理盐水3份充分混匀）。

　　4.1.2 1～2mL注射器、针头（用前煮沸消毒）、消毒盘、煮沸消毒器、镊子、耳夹子、工作服、口罩、线手套。

　　4.1.3 酒精、碘酒、硼酸、来苏尔、纱布、脱脂棉、记录表。

　　4.2 注射前检查结膜及眼睛是否单、双瞎等情况。注射后检查颌下淋巴结及有无鼻漏，并详细记录检查情况。

　　4.3 注射部位通常在左下眼睑边缘1～2cm内侧眼角三分之一处皮肤实质内，注射前用硼酸棉消毒注射部位。

　　4.4 注射前助手保定马匹，术者用食指、拇指捏住下眼睑，右手持注射器，手掌（小指外缘）支撑头部对左手捏起的眼睑皱襞术部斜向刺入下眼睑皮内，注入0.1mL鼻疽菌素，食指感觉注射液推进迟滞，局部呈现小包，即为药液已进入皮内。

　　4.5 注射一般在早晨。注射后第24、36、48小时分别进行检查。详细记录结果。

　　4.6 鼻疽菌素眼睑皮内注射反应判定标准：

　　4.6.1 阴性反应：无反应或下眼睑有极轻微肿胀、流泪的，为阴性反应。记录为“－”。

　　4.6.2 疑似反应：下眼睑稍肿胀，有轻微疼痛及发热，结膜潮红，无分泌物或仅有浆黏液性分泌物的，为疑似阳性，记录为“±”。

　　4.6.3 阳性反应：下眼睑肿胀明显，有显著的疼痛及灼热，结膜发炎畏光，有脓性分泌物的，为阳性。记录为“＋”。

　　5 开放性鼻疽临床诊断鉴别要领

　　5.1 将病畜保定，术者和助手穿工作服（避免白色），带胶皮手套、口罩、风镜及保护面具，先用3%来苏尔水，洗净病畜鼻孔内外后，在病畜前侧面适当位置，术者用手打开鼻孔，助手用反射镜或手电筒照射鼻腔深部，仔细检查黏膜上有无鼻疽特有结节溃疡及星芒状瘢痕及其它异状。检查完毕将服装、器材分别进行消毒（用3%来苏尔水浸1小时或煮沸10分钟），避免交叉传染。

　　5.2 鼻腔鼻疽临床症状如下：

　　5.2.1 鼻汁：初在鼻孔一侧（有时两侧）流出浆液性或黏液性鼻汁，逐渐变为不洁灰黄色脓性鼻汁，内混有凝固蛋白样物质，有时混有血丝并带有臭味，呼吸带哮鸣音。

　　5.2.2 鼻黏膜发生结节及溃疡：在流鼻汁同时或稍迟，鼻腔黏膜尤其是鼻中膈黏膜上出现新旧大小不同灰白色或黄白色的鼻疽结节，结节破溃构成大小不等、深浅不一、边缘隆起的溃疡（结节与溃疡多发生于鼻腔深部黏膜上），已愈者呈扁平如星芒状、冰花状的瘢痕。

　　5.2.3 颌下淋巴结肿大：急性或慢性鼻疽的经过期颌下淋巴结肿胀，初有痛觉，时间长久，则变硬、触摸无痛感，附着于下颌骨内面不动，有时也呈活动性。

　　5.3 皮肤鼻疽临床症状如下：

　　皮肤鼻疽多发于四肢、胸侧及下腹部，在皮肤或皮下组织发生黄豆大小或胡桃、鸡蛋大结节，不久破裂流出粘稠灰黄或红色脓汁（有时带血）形成浅圆形溃疡或向外穿孔呈喷火状溃疡。结节和溃疡附近淋巴结肿大，附近淋巴管粗硬呈念珠状索肿，肿胀周围呈水肿浸润，皮肤肥厚，有时呈蜂窝织炎，橡皮腿，公畜并发睾丸炎。

　　5.4 开放性鼻疽判定标准：

　　5.4.1 凡有5.2.1、5.2.2、5.2.3病变的，均为开放性鼻疽。

　　5.4.2 凡有第5.2.1病状而无5.2.2、5.2.3病状的或有5.2.1、5.2.3项病状而无5.2.2病状的，可用鼻疽菌素点眼，呈阳性反应的为开放性鼻疽。

　　5.4.3 凡有5.3症状的，即为开放性鼻疽。

　　5.5 不具备5.4项症状，并有可疑鼻疽临床症状的，判定为可疑开放性鼻疽。

　　6 鼻疽补体结合反应试验操作办法

　　6.1 采取被检血清

　　6.1.1 药品器材：

　　6.1.1.1 来苏尔、石炭酸、酒精、碘酒、纱布、脱脂棉。

　　6.1.1.2 灭菌试管、试管架、试管签、送血箱、煮沸消毒器、消毒盘、镊子、毛刷、毛剪、采血针（带胶管、每针采一次后必须清洗煮沸消毒后，再行使用）。

　　6.1.2 在被检牲畜颈前三分之一处静脉沟部位剪毛消毒，将灭菌采血针刺入颈静脉，使血液沿管壁流入试管内，防止血液滴入产生泡沫，引起溶血现象。

　　6.1.3 采出的血液，冬季应放置室内防止血清冻结，夏季应放置阴凉之处并迅速送往实验室。如在3昼夜内不能送到，应先将血清倒入另一灭菌试管内，按比例每1mL血清加入1～2滴5%石炭酸生理盐水溶液，以防腐败。运送时使试管保持直立状态，避免振动。

　　6.2 预备试验（溶血素、补体、抗原等效价测定）

　　6.2.1 准备下列材料

　　6.2.1.1 标准血清：鼻疽阴、阳性马血清。

　　6.2.1.2 鼻疽抗原。

　　6.2.1.3 溶血素。

　　6.2.1.4 补体：采取健康豚鼠血清。采血前饥饿7～8小时，于使用前一日晚由心脏采血，如检查材料甚多，需大量补体时，亦可由颈动脉放血，放于培养皿或试管中，待血液凝固后再轻轻划破或剥离血块后移于冰箱，次日清晨分离血清。如当日采血，可直接盛于离心管中，置恒温箱20分钟，将血块搅拌后，在离心器中分出血清亦可。每次补体应由3～4个以上豚鼠血清混合。

　　6.2.1.5 绵羊红细胞：绵羊颈静脉采血，脱纤防止血液凝固，并离心3次，以清洗红细胞；第一次1500～2000rp/m离心15分钟，吸出上清液加入细胞量3～4倍的生理盐水轻轻混合后做第二次离心，方法同前。使用前将洗涤后的细胞做成2.5%细胞液（即1：40倍溶液）。稀释后的红细胞最多保存一天，但离心后的红细胞在冰箱中可保存3～4日。

　　6.2.1.6 生理盐水：1000mL蒸馏水中加入8.5g氯化钠，灭菌后使用。

　　6.2.2 溶血素效价测定，每一月左右测价一次，按下列方法进行（参照表一）。

　　6.2.2.1 将稀释成1：100～1：5000不同倍数的溶血素血清各0.5mL分别置于试管中。

　　6.2.2.2 将1：20倍补体及1:40绵羊红细胞各0.5mL分别加入上述试管中。

　　6.2.2.3 另外制作缺少补体、缺少溶血素的对照管，并补充等量生理盐水。

　　6.2.2.4 每管分别添加生理盐水1mL，置于摄氏37～38℃水浴箱中15分钟。

　　6.2.2.5 观察结果：能完全溶血的最少量溶血素，即为溶血素的效价，也称为1单位（对照管均不应溶血），当补体滴定和正式试验时，则应用2单位（或称为工作量）即减少1倍稀释。

　　表一

溶血素稀释	1：100	1：500	1：1000	1：1500	1：2000	1：2500	1：3000	1：3500	1：4000	1：5000	对     照
溶血素 1：20补体 2.5%红细胞 生理盐水	0.5 0.5 0.5 1.0	0.5 0.5 0.5 1.0	0.5 0.5 0.5 1.0	0.5 0.5 0.5 1.0	0.5 0.5 0.5 1.0	0.5 0.5 0.5 1.0	0.5 0.5 0.5 1.0	0.5 0.5 0.5 1.0	0.5 0.5 0.5 1.0	0.5 0.5 0.5 1.0	- 0.5 0.5 1.5	0.5 - 0.5 1.5	- - 0.5 2.0

　　6.2.3 补体效价测定

　　每次进行补体结合反应试验，应于当日测定补体效价。先用生理盐水，将补体做1：20稀释，然后按表二进行操作。

　　表二                补体效价测定                 单位：mL    

管 号 成 分	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	对照管
											11	12	13
20倍补体 生理盐水 抗原（工作量）（不加抗原管加生理盐水） 10倍稀释阳性血清或10倍稀释阴性阴性血清	0.10 0.40 0.5 0.5	0.13 0.37 0.5 0.5	0.16 0.34 0.5 0.5	0.19 0.31 0.5 0.5	0.22 0.28 0.5 0.5	0.25 0.25 0.5 0.5	0.28 0.22 0.5 0.5	0.31 0.19 0.5 0.5	0.34 0.16 0.5 0.5	0.37 0.13 0.5 0.5	0.5 1.5 1.5 2.0

震荡均匀后置37～38℃水浴20分钟

二单位溶血素	0.5	0.5	0.5	0.5	0.5	0.5	0.5	0.5	0.5	0.5	/	0.5
2.5%红细胞悬液	0.5	0.5	0.5	0.5	0.5	0.5	0.5	0.5	0.5	0.5	0.5	0.5	0.5

振荡均匀后置37～38℃水浴20分钟

阳性血清加抗原 阳性血清未加抗原 阴性血清加抗原 阴性血清未加抗原

＃ ＃ ＃ ＃

＃ ＃ ＃ ＃

＃ ＃ ＃ ＃

＃ +++ +++ +++

＃ + ++ ++

＃ + + +

＃ — — —

＃ — — —

＃ — — —

+++ — — —

＃ ＃ ＃

　　补体效价：是指在2单位溶血素存在的情况下，阳性血清加抗原的试管完全不溶血，而在阳性血清未加抗原及阴性血清不论有无抗原的试管发生完全溶血所需最少补体量，就是所测得补体效价，如表二中第7管20×稀释的补体0.28mL即为工作量补体按下列计算，原补体在使用时应稀释的倍数：

　　补体稀释倍数

　　——————————×使用时每管加入量=原补体稀释倍数

　　测得效价

　　上列按公式计算为： 20/0.28×0.5=35.7

　　即此批补体应作1：35.7倍稀释，每管加0.5mL为一个补体单位。考虑到补体性质极不稳定，在操作过程中效价会降低，故使用浓度比原效价高10%左右。因此，本批补体应作1：35稀释使用，每管加0.5mL。

　　6.2.4 抗原效价，最少每半年滴定一次，具体操作方法如下（参照表三）：

　　6.2.4.1 将抗原原液稀释为1：10至1：500，各以0.5mL置于试管中，共作成12列。

　　6.2.4.2 在第1列不同浓度的抗原稀释液中，加入1：10的阴性马血清0.5mL；在第2列不同浓度的抗原稀释液中，加入生理盐水0.5mL；在第3列到第7列不同浓度的抗原稀释液中，分别加入1：10、1：25、1：50、1：75及1：100的强阳性马血清0.5mL。

　　表三

抗原稀释	1：10	1：50	1：75	1:100	1：150	1：200	1：300	1：400	1：500
抗原（mL） 阴（阳性）血清 补体（工作量）	0.5 0.5 0.5	0.5 0.5 0.5	0.5 0.5 0.5	0.5 0.5 0.5	0.5 0.5 0.5	0.5 0.5 0.5	0.5 0.5 0.5	0.5 0.5 0.5	0.5 0.5 0.5

37～38℃水浴箱中20分钟

2.5%红细胞	0.5	0.5	0.5	0.5	0.5	0.5	0.5	0.5	0.5	0.5
溶血素（工作量）	0.5	0.5	0.5	0.5	0.5	0.5	0.5	0.5	0.5	0.5

　　6.2.4.3 于前述各不同行列试管中，各加入补体（工作量）0.5mL。

　　6.2.4.4  置37～38℃水浴箱中20分钟。

　　6.2.4.5 加温后，各溶液中再加入0.5mL的2.5%红细胞及2单位溶血素后，再置37～38℃水浴箱中20分钟。

　　6.2.4.6 选择在不同程度的阳性血清中，产生最明显的抑制溶血现象的，在阴性血清及无血清之抗原对照中则产生完全溶血现象的抗原最大稀释量为抗原的工作量。

抗原效价测定结果观察举例

抗原稀释		1：10	1：50	1:70	1：100	1：150	1：200	1：300	1：400	1：500
血 清 稀 释	1:10 1:25 1:50 1:75 1:100	＃ ＃ ＋＋＋ ＋＋＋ ＋＋	＃ ＃ ＃ ＋＋ ＋＋	＃ ＃ ＃ ＋＋＋ ＋＋＋	＃ ＃ ＃ ＋＋＋ ＋＋＋	＃ ＃ ＃ ＋＋＋ ＋＋＋	＃ ＃ ＋＋＋ ＋＋ ＋	＋＋＋ ＋＋＋ ＋＋ ＋ -	＋＋＋ ＋＋ ＋ - -	++ + - - -

　　根据以上举例的结果，抗原的效价为1：150的稀释量。

　　6.3 正式试验

　　6.3.1 在6.2.1至6.2.4的预备试验基础上，进行正式试验（参照表四）

　　6.3.1.1 排列试管加入1：10稀释被检血清，总量为0.5mL，此管准备加抗原。另一管总量为1mL，不加抗原作为对照。

　　6.3.1.2 马血清在58～59℃加温30分钟，骡、驴血清在摄氏36～64℃加温30分钟。

　　6.3.1.3 加入鼻疽抗原（工作量）0.5mL。

　　6.3.1.4 加入补体（工作量）0.5mL。

　　6.3.1.5 加温后各试管中再加入2.5%红细胞稀释液0.5mL及2单位溶血素0.5mL。

　　6.3.1.6 再置37～38℃水浴箱中20分钟。

　　6.3.2 为证实上述操作过程中是否正确，应同时设置对照试验。

　　6.3.2.1 健康马血清

　　6.3.2.2 阳性马血清

　　6.3.2.3 抗原（工作量）

　　6.3.2.4 溶血素（工作量）

　　表四

正 式 试 验			对     照
			阴性血清		阳性血清		抗原	溶血素
生理盐水	0.45	0.9	0.45	0.9	0.45	0.9	-	1.0
被检血清	0.05	0.1	0.05	0.1	0.05	0.1	-	-

58～59（或63～64）℃水浴箱中30分钟

抗原（工作量）	0.5	－	0.5	－	0.5	－	1.0	－
补体（工作量）	0.5	0.5	0.5	0.5	0.5	0.5	0.5	0.5

37～38℃水浴箱中20分钟

2.5%红细胞	0.5	0.5	0.5	0.5	0.5	0.5	0.5	0.5
溶血素（工作量）	0.5	0.5	0.5	0.5	0.5	0.5	0.5	0.5

37～38℃水浴箱中20分钟

判定（举例）

＃

-

-

-

＃

-

-

-

　　6.3.3 加温完毕后，立即做第一次观察。阳性血清对照管须完全抑制溶血，其它对照管完全溶血，证明试验正确。静置室温12小时后，再做第二次观察，详细记录两次观察结果。

　　6.3.4 为正确判定反应结果，按下述办法制成标准比色管，以判定溶血程度（参照表五）。

　　6.3.4.1 置2.5%红细胞稀释液0.5、0.45～0.05（其参数为0.05）mL，于不同试管中，另一管不加。

　　6.3.4.2  选择6.3.1试验中完全溶血者数管混合（其参数为0.25），按下表份量顺次加入前项各不同量的红细胞稀释液中。

　　6.3.4.3 再补充生理盐水（即2.0、1.8～0.2mL等），使每管之总量为2.5mL。

　　表五

溶血程度（%）	0	10	20	30	40	50	60	70	80	90	100
2.5%红细胞 溶血素 生理盐水 总量	0.5 0 2.0 2.5	0.45 0.25 1.8 2.5	0.4 0.5 1.6 2.5	0.35 0.75 1.4 2.5	0.3 1.0 1.2 2.5	0.25 1.25 1.0 2.5	0.2 1.5 0.8 2.5	0.15 1.75 0.6 2.5	0.1 2.0 0.4 2.5	0.05 2.25 0.2 2.5	0 2.5 0 2.5

　　6.3.5 判定标准：

　　6.3.5.1 阳性反应

　　红细胞溶血0～10%者为＃；

　　红细胞溶血10～40%者为＋＋＋；

　　红细胞溶血40～50%者为＋＋；

　　6.3.5.2 疑似反应

　　红细胞溶血50～70%者为＋；

　　红细胞溶血70～90%者为±；

　　6.3.5.3 阴性反应

　　红细胞溶血90～100%者为－。

　　7 附表

　　鼻疽菌素点眼检疫记录表      年  月  日

编号	畜别	性别	年龄	特征	第一次点眼反应						第二次点眼反应						综合判定
					临床检查	3	6	9	24	判定	临床检查	3	6	9	24	判定

　　兽医：        （签名）

　　鼻疽菌素反应牲畜送血检血记录表    年   月   日

编号	畜别	临床症状	鼻疽菌素反应结果	采血日期	血管号码	补体结合反应			备注
						收血日期	检验日期	结果

兽医： （签名）