J-亚群禽白血病防治技术规范

　　J-亚群禽白血病(Avian Leukosis Virus-J Subgroup,简称ALV-J)，是由反转录病毒 ALV-J引起的主要侵害骨髓细胞，导致骨髓细胞瘤（ML）和其它不同细胞类型恶性肿瘤为特征的禽的肿瘤性传染性疾病。我国将其列为二类动物疫病。

　　为了预防、控制和消灭J-亚群禽白血病，依据《中华人民共和国动物防疫法》及有关的法律法规，特制定本规范。

　　1  适用范围

　　本规范规定了J-亚群禽白血病的诊断、疫情报告、疫情处理和预防措施。

　　本规范适用于中华人民共和国境内一切从事家禽饲养、经营及其产品的生产、经营，以及从事动物防疫活动的单位和个人。

　　2  诊断

　　根据本病流行病学特点、剖检病变和组织病理学变化可以做出初步诊断；确诊须进行病毒分离鉴定。

　　2.1  流行病学

　　所有品系的肉用型鸡都易感。蛋用型鸡较少发病。

　　病鸡或病毒携带鸡为主要传染源，特别是病毒血症期的鸡。与经典的ALV相似，ALV-J主要通过种蛋（存在于蛋清及胚体中）垂直传播，也可通过与感染鸡或污染的环境接触而水平传播。垂直传播而导致的先天性感染的鸡常可产生对病毒的免疫耐受，雏鸡表现为持续性病毒血症，体内无抗体并向外排毒。

　　2.2  临床症状：

　　潜伏期较长，因病毒株不同、鸡群的遗传背景差异等而不同。

　　最早可见5周龄鸡发病，但主要发生于18～25周龄的性成熟前后鸡群。总死亡率一般为2％～8％，但有时可超过10％。

　　2.3  剖检病变

　　特征性病变是肝脏、脾脏肿大，表面有弥漫性的灰白色增生性结节。在肾脏、卵巢和睾丸也可见广泛的肿瘤组织。有时在胸骨、肋骨表面出现肿瘤结节，也可见于盆骨、髋关节、膝关节周围以及头骨和椎骨表面。在骨膜下可见白色石灰样增生的肿瘤组织。

　　2.4  实验室诊断

　　2.4.1  病原分离鉴定（附件1）

　　2.4.2  组织病理学诊断

　　在HE染色切片中，可见增生的髓细胞样肿瘤细胞，散在或形成肿瘤结节。髓细胞样瘤细胞形体较大，细胞核呈空泡状，细胞浆较多，可见嗜酸性颗粒。

　　2.4.3  血清学诊断

　　采用J-亚群禽白血病酶联免疫吸附试验（ELISA）检测J-亚群禽白血病病毒抗体（附件2）。

　　2.5  结果判定

　　2.5.1  符合2.1、2.2和2.3的，临床诊断为疑似J-亚群禽白血病。

　　2.5.2  确诊

　　符合结果判定2.5.1，且符合实验室诊断2.4.1或2.4.2的。

　　采用2.4.3，检测为阳性，表明被检鸡群感染了J-亚群禽白血病病毒；检测为阴性，表明被检鸡群未感染J-亚群禽白血病病毒。

　　3  疫情报告

　　3.1  任何单位和个人发现患有本病或疑似本病的禽类，应及时向当地动物防疫监督机构报告。

　　3.2  当地动物防疫监督机构接到疫情报告后，按国家动物疫情报告管理的有关规定执行。

　　4  疫情处理

　　根据流行病学特点、临床症状、剖检病变，结合病原分离鉴定、组织病理学和血清学检测做出的诊断结果可作为疫情处理的依据。

　　4.1  发现疑似疫情时，养殖户应立即将病禽及其同群禽隔离，并限制其移动。当地动物防疫监督机构要及时派员到现场进行调查核实，包括流行病学调查、临床症状检查、病理解剖、采集病料、实验室诊断等，根据诊断结果采取相应措施。

　　4.2  当疫情呈散发时,须对发病禽群进行扑杀和无害化处理（按照GB 16548进行）。同时，对禽舍和周围环境进行消毒（附件3），对受威胁禽群进行观察。

　　4.3  当疫情呈暴发时按照以下要求处理

　　4.3.1  划定疫点、疫区、受威胁区

　　由所在地县级以上（含县级）兽医主管部门划定疫点、疫区、受威胁区。

　　疫点：指患病禽类所在的地点。一般是指患病禽类所在的禽场（户）或其它有关屠宰、经营单位；如为农村散养，应将自然村划为疫点。

　　疫区：指疫点外延3公里范围内区域。疫区划分时，应注意考虑当地的饲养环境和天然屏障（如河流、山脉等）。

　　受威胁区：指疫区外延5公里范围内的区域。

　　4.3.2  处置要求

　　在动物防疫监督机构的监督指导下，扑杀发病禽群，并对扑杀禽和病死禽只进行无害化处理；对环境和设施进行消毒；对粪便及其它可能被污染的物品，按照GB 16548进行无害化处理；禁止疫区内易感动物移动、交易。

　　禽类尸体需要运送时，应使用防漏容器，并在动物防疫监督机构的监督下实施。

　　4.3.3进行疫源分析和流行病学调查

　　4.3.4  处理记录

　　对处理疫情的全过程必须做好完整的详细记录，以备检查。

　　5  预防与控制

　　实行净化种群为主的综合性防治措施。

　　5.1  加强饲养管理，提高环境控制水平

　　饲养、生产、经营等场所必须符合《动物防疫条件审核管理办法》（农业部15号令）的要求，并须取得动物防疫合格证。

　　饲养场实行全进全出饲养方式，控制人员出入，严格执行清洁和消毒程序。

　　5.2  加强消毒管理，做好基础防疫工作

　　各饲养场、屠宰厂（场）、动物防疫监督检查站等要建立严格的卫生（消毒）管理制度。

　　5.3  监测

　　养禽场应做好死亡鸡肿瘤发生情况的记录，并接受动物防疫监督机构监督。

　　5.4  引种检疫

　　国内异地引入种禽时，应经引入地动物防疫监督机构审核批准，并取得原产地动物防疫监督机构出具的无J-亚群禽白血病证明和检疫合格证明。

　　附件1

J-亚群禽白血病病原分离

　　1  鸡胚成纤维细胞（CEF）的制备

　　取10～12日龄SPF鸡胚按常规方法制备CEF，置于35㎜～60㎜平皿或小方瓶中。待细胞单层形成后，减少维持用培养液中的血清至1％左右。

　　2  病料的处理和接种

　　2.1  血清或血浆样品：从疑似病鸡无菌采血分离血清或血浆，于35㎜～60㎜带CEF的平皿或小方瓶中加入0.2mL～0.5mL血清或血浆样品。

　　肝、脾、肾组织样品：取一定量（1～2克）组织研磨成匀浆后，按1：1加入无菌的PBS，置于1.5 mL离心管中10000g离心20分钟，用无菌吸头取出上清液，移入另一无菌离心管中，再于10000g离心20分钟，按10000IU/ mL量加入青霉素后，在带有CEF的平皿或小方瓶中接种0.2mL～0.5mL。

　　2.2  接种后浆平皿或小方瓶置于37℃中培养3小时后，重新更换培养液，继续培养7天，其间应更换1次培养液。

　　2.3  以常规方法，用胰酶溶液将感染的CEF单层消化后，再作为第2代细胞接种于另一块带有3～4片载玻片的35㎜～60㎜平皿中，继续培养7天。

　　3  病毒的检测

　　用以下方法之一检测病毒。

　　3.1  IFA：将带有感染的CEF的载玻片取出，用丙酮－乙醇（7：3）混合液固定后，用ALV－J单克隆抗体或单因子血清及FITC标记的抗小鼠或抗鸡Ig标记抗体按通常的方法做间接荧光试验。在荧光显微镜下观察有关呈病毒特异性荧光的细胞。

　　3.2  PCR：从CEF悬液提取基因组DNA作为模板，以已发表的ALV-J特异性引物为引物，直接测序；或克隆后提取原核测序，将测序结果与已发表的ALV-J原型株比较，基因序列同源性应在85％以上。

　　注意：由于内源性ALV的干扰作用，按严格要求，病毒应接种在对内源性ALV有抵抗作用的CEF/E品系鸡来源的细胞或细胞系（如DF1）。但我国多数实验室无法做到这点，在结果判定时会有一点风险。如果3.1、3.2都做了，相互验证，可以大大减少风险。

　　附件2

J-亚群禽白血病酶联免疫吸附试验（ELISA）

　　本方法可检测鸡血清中J-亚群禽白血病病毒抗体。适用于J-亚群禽白血病病毒水平感染的群体普查。

　　1  样品准备

　　检测之前要用样品稀释液将被检样品进行500倍稀释（如：1μL的样品可以用样品稀释液稀释到500μL）。注意不要稀释对照。不同的样品要注意换吸头。在将样品加入检测板前要将样品充分混匀。

　　2  洗涤液制备

　　(10X)浓缩的洗涤液在使用前必须用蒸馏水或去离子水进行10倍稀释。如果浓缩液中含有结晶，在使用前必须将它融化。（如：30mL的浓缩洗涤液和270mL的蒸馏水或去离子水充分混合配成）。

　　3  操作步骤

　　将试剂恢复至室温，并将其振摇混匀后进行使用。

　　3.1  抗原包被板并在记录表上标记好被检样品的位置。

　　3.2  取100μL不需稀释的阴性对照液加入A1孔和A2孔中。

　　3.3  取100μL不需稀释的阳性对照液加入A3孔和A4孔中。

　　3.4  取100μL稀释的被检样品液加入相应的孔中。所有被检样品都应进行双孔测定。

　　3.5  室温下孵育30分钟。

　　3.6  每孔加约350μL的蒸馏水或去离子水进行洗板，洗3～5次。

　　3.7  每孔加100μL的酶标羊抗鸡抗体（HRPO）。

　　3.8  室温下孵育30分钟。

　　3.9  重复第6步。

　　3.10  每孔加100μL的TMB底物液。

　　3.11  室温下孵育15分钟。

　　3.12  每孔加100μL的终止液。

　　3.13  酶标仪空气调零。

　　3.14  测定并记录各孔于650nm波长的吸光值（A650）。

　　4  结果判定

　　4.1  阳性对照平均值和阴性对照平均值的差值大于0.10，阴性对照平均值小于或等于0.150，该检测结果才能有效。

　　4.2  被检样品的抗体水平由其测定值与阳性对照测定值的比值（S/P）确定。抗体滴度按下列方程式进行计算。

　　阴性对照平均值NC=[A1（A650）+A2（A650）]/2

　　阳性对照平均值PC=[A3（A650）+A4（A650）]/2

　　S/P比值=（样品平均值-NC）/（PC -NC ）

　　4.3  S/P比值小于或等于0.6，判为阴性。

　　4.4  S/P值大于0.6，判为阳性，表明被检血清中存在J-亚群禽白血病病毒抗体。

　　附件3

消      毒

　　1  消毒前的准备

　　1.1  消毒前必须清除有机物、污物、粪便、饲料、垫料等；

　　1.2  消毒药品必须选用对J-亚群禽白血病病毒有效的，如烧碱、醛类、氧化剂类、酚制剂类、氯制剂类、双季胺盐类等。

　　1.3  备有喷雾器、火焰喷射枪、消毒车辆、消毒防护器械（如口罩、手套、防护靴等）、消毒容器等。

　　1.4  注意消毒剂不可混用.

　　2  消毒范围

　　禽舍地面及内外墙壁，舍外环境；饲养、饮水等用具，运输等设施设备以及其它一切可能被污染的场所和设施设备。

　　3  消毒方法

　　3.1  金属设施设备的消毒，可采取火焰、熏蒸等方法消毒；

　　3.2  圈舍、场地、车辆等，可采用消毒液清洗、喷洒等方法消毒；

　　3.3  养禽场的饲料、垫料等，可采取深埋发酵处理或焚烧处理等方法消毒；

　　3.4  粪便等可采取堆积密封发酵或焚烧处理等方法消毒；

　　3.5  饲养、管理等人员可采取淋浴等方法消毒；

　　3.6  衣帽鞋等可能被污染的物品，可采取浸泡、高压灭菌等方法消毒；

　　3.7  疫区范围内办公、饲养人员的宿舍、公共食堂等场所，可采用喷洒的方法消毒；

　　3.8  屠宰加工、贮藏等场所以及区域内池塘等水域的消毒可采取相应的方法进行，并避免造成有害物质的污染。